云南红豆杉叶斑病病原菌的星散判定和生物学特征

云南红豆杉(TaxusyunnanensisChengetLu)别称紫杉、赤柏松，属红豆杉科乔木，产于云南西北部及西部、四川西南部与西藏东部，是生产紫杉醇的重要树种[1-3]。云南红豆杉是集用材、药用、绿化于一体的珍贵树种，特别是其紫杉醇含量远远高于其他红豆杉树种[4]。紫杉醇具有抗癌活性，云南红豆杉的野生资本比较少，人工培育红豆杉是现在获取紫杉醇较可行、有用的途径[1，5]。为了更好地保护野生云南红豆杉野生资本，大力培育后续产业，以满足市场对云南红豆杉资本的需求，近年来在云南丽江、大理、楚雄和丘北等地成立了云南红豆杉人工栽植林。由于云南红豆杉的普遍种植，病害发生严重，尤其是云南红豆杉叶片叶斑病现象日趋普遍，影响了树势生长及药用、观赏价值。星散与判定病原菌是开展云南红豆杉抗病防治研究的基础。本试验从自然感病的云南红豆杉上星散纯化得到1株对云南红豆杉具有寄生作用的真菌，利用传统的形态学观测与现代分子生物学技术相结合的方式，对云南红豆杉叶斑病病原菌举行了判定，并依据其形态特点与培育性状举行了开端研究，为云南红豆杉叶斑病的防治奠基了基础，同时也为进一步了解该病害的发病纪律提供了一定的理论依据。
1质料与方式
1.1病原菌的星散
云南红豆杉叶斑病叶片采自云南省楚雄市西山，用组织星散法星散病原菌，经科赫氏法判定其为云南红豆杉叶斑病的病原，菌株编号为hongdoushan02。
1.2病原菌的判定
1.2.1形态学判定利用显微镜观测纯化星散到的病原菌，并对其举行形态判定。
1.2.2病原菌rDNA-ITS序列扩增和分解用CTAB法提取病原菌全基因组DNA，举行ITS-PCR扩增。引物序列为ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反映系统总体积25μL，反映各因素终浓度为：Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反映缓冲液。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃复性45s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产品送北京百泰克生物技术有限公司测序，所得序列在NCBI上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1软件采取NJ法举行系统分解，构建系统进化树。
1.3生物学特征研究[6-7]
1.3.1不同碳源和氮源对菌落生长的影响
以察氏培育基为基础培育基，划分以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；划分以硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、卵白胨取代氮源。每种培育基中划分接种直径为5mm的菌块，25℃恒温漆黑培育，5d后用“十”字交织法测量菌落直径。每个处理设3个重复。
1.3.2不同温度对菌落和分生孢子萌发的影响
取直径为5mm的菌块接种于察氏培育基中心，划分在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃漆黑下恒温培育，5d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培育条件同菌落培育，24h后镜检孢子萌发率，每次检100个孢子。每个处理设3个重复。
1.3.3不同pH值对菌落和分生孢子萌发的影响
将高压灭菌后的察氏培育基pH值划分调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9倒平板，取直径5mm的菌块接种于察氏培育基中心，漆黑条件下25℃培育5d后测量菌落直径。用0.2mol/L磷酸氢二钠和0.2mol/L柠檬酸缓冲液将分生孢子悬浮液pH值调配为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25℃恒温箱漆黑培育，24h后镜检萌发率，每次检100个孢子。每个处理设3个重复。
1.3.4不同光照处理
取直径为5mm的菌块接种于察氏培育基中心，划分置于24h光照、12h/12h光暗交替、24h漆黑环境中，25℃培育5d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培育条件同菌落培育，24h后镜检孢子萌发率，每次镜检100个孢子。每个处理设3个重复。
1.4不同杀菌剂对菌落生长的影响
将代森锰锌、百菌清、敌克松、霜·锰锌和扑海因用无菌水按其常用倍数稀释，每10mL培育基中加入1mL药液制成含药液的平板，比较组加入等量无菌水。取5mm菌块置于察氏培育基平板中心，25℃漆黑培育5d后测量菌落直径。每个处理设3个重复。
2效果与分解
2.1云南红豆杉病原菌的判定
2.1.1形态学判定
该病重要发生在叶部，发病初期叶片中部出现多个黄褐色病斑，病斑边缘玄色，随着病情的生长，可延伸至整个叶片，使叶片枯萎死亡。在PDA培育基上，28℃培育6d菌落直径达4cm，菌落青灰色相间，圆形、规则，边缘整齐，菌丝絮状，培育一段时间后可看到培育皿盖上有水珠；后头轮纹状，中心圆褐色，外围一环黄色；菌落生长缓慢(图1)。菌丝有隔，淡褐色，产孢细胞孔生式产孢，合轴式延伸或有时不再延伸；分生孢子多串生(向顶系列)，有的单生，卵形或倒棍棒形，具喙，淡橄榄褐至橄榄褐色或褐色，滑腻，具横隔膜及纵向隔膜，大小(2.4～6.2)μm×(2.9～7.1)μm(均匀2.65μm×6.65μm)。分生孢子顶端或喙部，常孔生式发生新的分生孢子，云云联系发生，形因素枝或不分枝的孢子链(图2、图3)。